做转染的读者大概都有同款体验：mRNA又脆又"挑细胞"——进细胞前容易被核酸酶降解，好不容易进去了还常被扣在内涵体里出不来；换商用转染试剂，在难转染细胞上经常翻车，阳离子脂质的毒性顾虑还限制着用量和频次。

2025年，帝国理工学院Rupali Dabas等在《Materials Today Bio》上发表研究论文，题为"Precise intracellular uptake and endosomal release of diverse functional mRNA payloads via glutathione-responsive nanogels"。

一句话结论：他们把mRNA装进带二硫键"锁扣"的纳米凝胶，利用细胞内外的谷胱甘肽（GSH）浓度差（胞外2–20 μM、胞内1–10 mM），让RNA只在进入细胞质后才"开锁"释放——最优配方包封率92.7%，在6株细胞（含难转染细胞）中的表达量超过两种商用转染试剂。

一、mRNA递送的卡点：进得去、出不来、存不住

mRNA疫苗的成功把递送载体推到了台前，但主角LNP并非没有短板：阳离子脂质会带来毒性反应，难以频繁给药；结构设计上也缺少"按时释放"的可控旋钮。

纳米凝胶（NG）是另一条路线：一种纳米尺度的水凝胶网络，可以把多种功能基团共聚进同一骨架，负载能力强、生物相容性好。团队目标很明确：粒径小于200 nm、PI低于0.2、电位足够促摄取，且只在胞内GSH环境中解体。

二、载体设计：五种"阳离子抓手"＋一把二硫键"锁"

骨架用自由基聚合一步搭成：丙烯酰胺单体、阳离子单体与mRNA一起，在含二硫键的PEG交联剂（SS-DiA）参与下交联成网，聚合30分钟即完成，尽量缩短RNA的"暴露"时间（Figure 1）。

 

Figure 1｜二硫键纳米凝胶的合成示意（a）与所筛五种阳离子单体的化学结构（b）

阳离子单体相当于"抓手"，负责静电抓住带负电的RNA。团队筛了5种：商用的AETC、DMA，以及新设计的聚精氨酸PolyR、聚组氨酸PolyH和丙烯酰胍AC-GUA——分别靠胍基、咪唑环与RNA结合，兼具促内体逃逸的潜力。

表征结果（Figure 2）显示：AETC_NG（24 mol%，141.1 nm）与PolyR_NG（14 mol%，168.9 nm）电位最正、包封最好，凝胶几乎测不到游离RNA，RNase环境下也能护住RNA。各配方明细见表1。

 

Figure 2｜五种纳米凝胶的粒径与PI（a）、TEM形貌（b）、Zeta电位（c）及mRNA包封率/载药量（d）

表1｜五种阳离子纳米凝胶横向对比（据原文正文数据整理，完整数据见原文）

配方	最优投料	粒径/PI	Zeta电位	包封率	特点
AETC_NG	24 mol%	141.1 nm/0.169	23.9 mV	92.7%	结构最稳，释放最快（24 h 75.3%）
PolyR_NG	14 mol%	168.9 nm/0.094	28.8 mV	82.3%	释放最慢（24 h 54.4%），缓释向
PolyH_NG	14 mol%	<200 nm	最低	较低	胞外GSH下也漏（67.2%），欠稳定
AC-GUA_NG	24 mol%	<200 nm	较低	较低	转染效率最低
DMA/AETC_NG	3:1	<200 nm	较低	较低	阳离子电荷低，毒性最小

 

三、GSH当钥匙：进细胞才"开锁"放货

这套设计的核心是阈值响应：凝胶泡在胞外浓度的GSH（20 μM）里48小时，各配方几乎不漏（PolyH除外，漏了67.2%，电位不稳是主因）；换成10 mM（胞内浓度），所有纳米凝胶都在48小时内持续、彻底地释放mRNA（Figure 3）。

 

Figure 3｜20 μM GSH（a–c）与10 mM GSH（d–h）处理下的粒径、PI、电位变化及累计mRNA释放曲线

释放节奏还由单体决定：AETC_NG 24小时放出75.3%，PolyR_NG只放54.4%——换配方就是调释放曲线，想快想慢都有得选。

四、二硫键的第二重身份：帮载体进门、越狱

二硫键不只是"锁"。荧光标记对比实验（Figure 4）显示：HeLa细胞对含二硫键凝胶的摄取高出约2.5倍，加入硫醇阻断剂AspA后这一优势消失——说明二硫键会与细胞膜表面的硫醇互作，走了一条促摄取的捷径。

 

Figure 4｜含/不含二硫键凝胶的细胞摄取（a–c）与内体逃逸时程、Pearson系数（d–i）

出了细胞膜还得出内涵体：12小时时含二硫键组的Pearson系数为0.49（越低越"自由"），对照组高达0.79；24小时前者降到0.41，后者仍滞留在内涵体里。五种配方中，AETC与PolyR的逃逸同样最好。

五、实战检验：6株细胞与一种"能干活"的蛋白

装载GFP mRNA后，纳米凝胶给出延迟而持久的表达曲线：商用试剂12小时即达峰，凝胶约24小时达峰、表达拖得更长，与体外受控释放的行为一致。按总蛋白归一后，40与60 μg/mL的AETC_NG反超商用试剂（Figure 7a、b）。

 

Figure 7｜AETC_NG在六株细胞中的GFP表达（a）、与商用试剂的效率对比（b）及细胞活性（c）

六株细胞里既有好转的HEK293T、HeLa、Caco-2、C4-2，也有出了名难转的bEND.3和RAW264.7。AETC_NG在250 μg/mL内细胞活性几乎无损，而商用试剂在RAW264.7、Caco-2和bEND.3中的毒性更明显。

真正的"功能题"是递送β2-AMPK mRNA：在β2敲除的HEK293T细胞中，β2表达升至未处理组的7.7倍、为商用试剂的1.5倍；AMPK的Thr172磷酸化与下游ULK1磷酸化同步回升，表达出的蛋白还能完成自身的豆蔻酰化修饰——递进去的mRNA是"能干活"的（Figure 9）。

平台还兼容Mango II RNA适配体，配合TIRF单分子计数，能数清单个凝胶里装载的RNA条数。

 

Figure 9｜β2-AMPK mRNA递送恢复AMPK磷酸化通路（a）与β2表达定量（b）

边界也要说清：RNA越长包封越难（2097 nt时包封率降到60%）；浓度高于250 μg/mL仍出现明显细胞毒性；内体逃逸的确切机制尚未定论，研究目前止步于体外。

六、给读者的三点收获

① 思路可移植：想"到点才释放"，先找细胞内外的浓度差——GSH、pH、酶都是现成的"钥匙"，二硫键是最常用的"锁"。

② 旋钮在单体：换阳离子单体＝同时调结合力、释放速度与逃逸效率；AETC求稳求量，PolyR求缓释。

③ 边界要看清：长链mRNA包封率会打折，高浓度仍需警惕毒性，体内数据仍是空白。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2024.101425

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